Peamine erinevus - kloonimine vs alakloonimine
Kloonimine ja alakloonimine on molekulaarbioloogilised protseduurid, mis loovad geneetiliselt identsed rakud või organismid, millel on huvi pakkuv DNA või geen. Kloonimine on meetod, mis hõlmab huvitava geeni või DNA sisestamist vektorisse, selle replikatsiooni peremeesbakteris ning rakkude või organismide tootmist, mis on geneetilise koostise täpsed koopiad. Subkloonimine on tehnika, mis hõlmab juba vektorisse sisestatud huvipakkuva geeni sisestamist sekundaarsesse vektorisse, selle paljunemist peremeesbakteris ning rakkude või organismide geneetiliselt identsete koopiate tootmist. Peamine erinevus kloonimise ja subkloonimise vahel on see, et kloonimisel jätkab huvipakkuv geen pärast vektoriga ligeerimist kloonimisprotsessi, samal ajal kui subkloonimiseljuba huvitatud kloonitud huvipakkuv geen eraldatakse algvektorist ja sisestatakse uuesti retsipientvektorisse ning jätkatakse protsessi.
SISU
1. Ülevaade ja peamine erinevus
2. Mis on kloonimine
3. Mis on alakloonimine
4. Võrdlus kõrvuti - kloonimine vs alakloonimine
5. Kokkuvõte
Mis on kloonimine?
Kloonimine on protseduur, mis toodab geneetiliselt identseid organisme või rakke. Looduses toimub kloonimine mittesugulise paljunemise teel. Kui geneetilist rekombinatsiooni või muutusi ei toimu, saavad tütrerakud sama vanema geneetilise koosseisu. Prokarüootsed ja eukarüootsed organismid loovad kloonid binaarse lõhustumise, tärkamise, mitoosi jne abil. Molekulaarbioloogias on geenide või DNA spetsiifiliste fragmentide kloonimine populaarne meetod selle konkreetse DNA sektsiooni struktuuri ja funktsiooni uurimiseks.
Molekulaarse kloonimise peamine eesmärk on teha miljoneid koopiaid geneetiliselt identsetest rakkudest või organismidest, millel on huvipakkuv DNA fragment (peamiselt geenid). See loob organismid, millel on teise täpsed geneetilised koopiad. Struktuurilise ja funktsionaalse teabe saamiseks ning DNA järjestamiseks kloonitakse molekulaarsetes uuringutes peamiselt spetsiifilisi geene. Spetsiifiliste valkude või toodete suures mahus tootmiseks kasutatakse laialdaselt ka kloonimist.
Kloonimisprotseduur
Kloonimisprotseduuri põhietapid on järgmised.
- Huvipakkuva geeni identifitseerimine ja eraldamine. (Huvipakkuva geeni amplifikatsioon PCR abil).
- Huvipakkuva geeni piirav seedimine (restriktsiooni endonukleaas lõikab geeni).
- Vektor-DNA piirav seedimine. (Sama DNA restriktsiooni endonukleaasi abil lõigatakse ka vektor-DNA).
- Geeni sisestamine vektorisse ja rekombinantse molekuli moodustumine.
- Rekombinantse vektori transformatsioon peremeesbakteriks.
- Transformeeritud bakterite eraldamine ja identifitseerimine (plasmiidivektor peaks sisaldama selekteeritavat geeni, kõige sagedamini antibiootikumiresistentsuse geeni transformeeritud bakterite skriinimiseks).
- Rekombinantse geeni ekspressioon peremeesorganismis.
Joonis_01: kloonimisprotseduur
Mis on subkloonimine?
Subkloonimine on protseduur huvipakkuva geeni viimiseks ühest vektorist teise vektorisse, et näha geeni ekspressiooni geeni soovitud funktsionaalsuse saavutamiseks. Selles meetodis on kaasatud kaks vektorit; nimelt vanemvektor ja sihtvektor. Kloonitud sisestused viiakse subkloonimisel uuesti teise vektorisse. Geeni ülekandmine esimesest vektorist teise vektorisse on eesmärk saada midagi, mida esimene vektor ei suutnud teha, või eraldada geen uuesti DNA juba kloonitud fragmendis ja ekspresseerida seda üksi. Selle protseduuri alguses kasutatakse piiravaid ensüüme.
Subkloonimise protseduur
Subkloonimise põhietapid on järgmised.
- Restriktsiooni endonukleaaside abil huvipakkuva DNA eraldamine doonorplasmiidis (algvektor).
- Huvipakkuva DNA amplifitseerimine PCR abil.
- PCR saaduse (huvipakkuva DNA) puhastamine geelelektroforeesiga.
- Vastuvõtva plasmiidi avamine sama restriktsiooni endonukleaaside abil, mida kasutati huvipakkuva DNA eraldamiseks lähteplasmiidis.
- Huvipakkuva DNA (geeni) ligeerimine retsipientplasmiidi, et luua alamkloonitud plasmiid.
- Subkloonitud vektori muundamine pädevaks peremeesbakteriks.
- Transformeeritud rakkude sõelumine.
- Plasmiidi DNA puhastamine ja kasutamine DNA järjestamiseks või geenide ekspresseerimiseks soovitud saaduste saamiseks.
Subkloonimine viiakse läbi ühe geeni isoleerimise korral kloonitud geenirühmast või kui huvipakkuv geen on vajalik üle kandmiseks kasulikku plasmiidi, et näha huvipakkuva geeni täpset funktsiooni.
Joonis_02: alakloonimise protseduur
Mis vahe on kloonimisel ja alakloonimisel?
Erinev artikkel keskel enne tabelit
Kloonimine vs alakloonimine |
|
| Kloonimine on protseduur, mis toodab geneetiliselt identseid organisme või rakke. | Subkloonimine on protseduur huvipakkuva geeni viimiseks ühest vektorist teise vektorisse, et näha geeni ekspressiooni geeni soovitud funktsionaalsuse saavutamiseks. |
| Protsess | |
| Eraldage huvipakkuv DNA organismist ja sisestage üks kord vektorisse ning kloonige | Juba kloonitud DNA eraldatakse esimesest vektorist, sisestatakse teise vektorisse ja kloonitakse. |
| Sisesta liikumine vektorite kaudu | |
| Ei liiguta sisestusi (huvipakkuv DNA) ühest vektorist teise. | Teisalda sisestused vanemvektorist sihtvektorisse. |
Kokkuvõte - kloonimine vs alakloonimine
Kloonimine loob huvipakkuvale sisestatud geenile või DNA-le geneetiliselt identsed rakud või organismid. See toimub huvipakkuva DNA eraldamise ja sisestamise kaudu vektorisse ning ekspressiooni peremeesbakteris. Subkloonimisel jagatakse kloonimisega sarnaseid samme. Subkloonimisel sisestatakse aga juba kloonitud DNA fragment (huvipakkuv geen) vektorisse ja transformeeritakse peremeesbakteriks. See on peamine erinevus kloonimise ja subkloonimise vahel.
