Peamine erinevus - NGS vs Sangeri järjestamine
Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) ja Sangeri järjestamine on aja jooksul välja töötatud kahte tüüpi nukleotiidide järjestamise tehnikad. Sangeri sekveneerimismeetodit kasutati palju aastaid ja NGS asendas selle hiljuti oma eeliste tõttu. Peamine erinevus NGS-i ja Sangeri sekveneerimise vahel on see, et NGS töötab miljonite järjestuste samaaegse järjestamise põhimõttel järjestussüsteemi kaudu, samal ajal kui Sangeri järjestamine töötab ahela lõpetamise põhimõttel, mis on tingitud dideoksünukleotiidide selektiivsest lisamisest DNA polümeraasi ensüümi poolt DNA replikatsiooni ajal ja sellest tulenevalt fragmentide eraldamine kapillaarelektroforeesi teel.
SISU
1. Ülevaade ja peamine erinevus
2. Mis on nukleotiidide järjestamine
3. Mis on NGS
4. Mis on Sangeri järjestamine
5. Kõrvuti võrdlus - NGS vs Sangeri järjestamine
6. Kokkuvõte
Mis on nukleotiidide järjestamine?
Geneetiline teave on salvestatud organismi DNA või RNA nukleotiidjärjestustesse. Protsess nukleotiidide õige järjestuse määramiseks (kasutades nelja alust) antud fragmendis (geenis, geenikobaras, kromosoomis ja täielikus genoomis) on tuntud kui nukleotiidide järjestamine. Genoomiuuringutes, kohtuekspertiisides, viroloogias, bioloogilises süstemaatikas, meditsiinilises diagnoosimises, biotehnoloogias ja paljudes muudes valdkondades on geenide struktuuri ja funktsiooni analüüsimine väga oluline. Teadlaste välja töötatud sekveneerimismeetodeid on erinevaid. Nende seas oli Frederick Sangeri poolt 1977. aastal välja töötatud Sangeri järjestamine laialt levinud ja populaarne pikka aega, kuni järgmise põlvkonna järjestus selle asendas.
Mis on NGS?
Järgmise põlvkonna järjestamine (NGS) on termin, mida kasutatakse tänapäevaste suure jõudlusega sekveneerimisprotsesside tähistamiseks. Selles kirjeldatakse mitmeid erinevaid kaasaegseid sekveneerimistehnoloogiaid, mis muutsid genoomiuuringuid ja molekulaarbioloogiat. Need meetodid on Illumina sekveneerimine, Roche 454 sekveneerimine, ioonprootonite järjestamine ja SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) järjestamine. NGS-süsteemid on kiiremad ja odavamad. NGS-süsteemides kasutatakse nelja peamist DNA järjestamise meetodit, nimelt; pürosekveneerimine, sekveneerimine sünteesi teel, sekveneerimine ligeerimise teel ja ioonpooljuhtide sekveneerimine. Paralleelselt võib järjestada suure hulga DNA või RNA ahelaid (miljoneid). See võimaldab järjestada kogu organismide genoomi lühikese aja jooksul, erinevalt Sangeri järjestusest, mis võtab rohkem aega.
NGS-il on tavapärase järjestamise Sangeri meetodiga võrreldes palju eeliseid. See on kiire, täpsem ja tasuvam protsess, mida saab läbi viia väikese valimi suurusega. NGS-i saab kasutada metagenoomilistes uuringutes, insertsioonide ja deletsioonide jms põhjustatud variatsioonide tuvastamisel individuaalses genoomis ning geeniekspressioonide analüüsimisel.
Joonis_1: NGS järjestuse areng
Mis on Sangeri järjestamine?
Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri ja tema kolleegide poolt 1977. aastal välja töötatud sekveneerimismeetod antud DNA fragmendi täpse nukleotiidijärjestuse määramiseks. Seda tuntakse ka kui ahela lõpetamise järjestust või dideoksü järjestust. Selle meetodi tööpõhimõte on ahelasünteesi lõpetamine DNA-replikatsiooni käigus DNA polümeraasi abil ahela lõppevate dideoksünukleotiidide (ddNTP) nagu ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP selektiivse lisamisega. Normaalsetes nukleotiidides on 3 'OH rühmad fosfodiestersideme moodustamiseks külgnevate nukleotiidide vahel, et jätkata ahela moodustumist. DdNTP-del puudub see 3'OH rühm ja nad ei suuda moodustada nukleotiidide vahel fosfodiestersidemeid. Seega on ahela pikenemine lakanud.
Selles meetodis toimib sekveneeritav üheahelaline DNA matriitsina in vitro DNA sünteesil. Muud nõuded on oligonukleotiidi praimer, deoksünukleotiidi prekursorid ja DNA polümeraasi ensüüm. Kui sihtmärkfragmenti külgnevad otsad on teada, saab DNA replikatsiooniks hõlpsasti kavandada praimereid. Neli eraldi tuubis viiakse läbi neli eraldi DNA sünteesimisreaktsiooni. Igal torul on eraldi ddNTP-d koos muude nõuetega. Konkreetsest nukleotiidist lisatakse dNTP ja ddNTP segu. Samamoodi viiakse läbi neli eraldi reaktsiooni neljas katseklaasis nelja seguga. Pärast reaktsioone viiakse läbi DNA fragmentide tuvastamine ja fragmentide mustri muundamine järjestuse informatsiooniks. Saadud DNA fragmendid denatureeritakse ja eraldatakse geelelektroforeesiga. Radioaktiivsete nukleotiidide kasutamisel saab polüakrüülamiidgeelil esinevat ribamustrit visualiseerida autoradiograafia abil. Kui selles meetodis kasutatakse fluorestseeruvalt märgistatud dideoksünukleotiide, saab seda leevendada loetud geelil ja viia läbi laserkiire, et fluorestsentsdetektor tuvastada. Vigade vältimiseks, mis võivad tekkida, kui järjestust loevad silm ja loendisse sisestatakse käsitsi, arenes see meetod arvutiga ühendatud automatiseeritud järjestusseadme kasutamiseks. Vigade vältimiseks, mis võivad ilmneda, kui järjestust loetakse silma abil ja sisestatakse käsitsi arvutisse, arenes see meetod arvutiga ühendatud automatiseeritud järjestusseadme kasutamiseks. Vigade vältimiseks, mis võivad tekkida, kui järjestust loevad silm ja loendisse sisestatakse käsitsi, arenes see meetod arvutiga ühendatud automatiseeritud järjestusseadme kasutamiseks.
Seda meetodit kasutatakse inimese genoomi projekti DNA järjestamiseks. Seda meetodit kasutatakse endiselt täiustatud muudatustega, kuna see annab täpset teavet järjestuse kohta, hoolimata sellest, et see on kallis ja aeglane protsess.
Joonis_2: Sangeri järjestamine
Mis vahe on NGS-il ja Sangeri järjestamisel?
Erinev artikkel keskel enne tabelit
NGS vs Sangeri järjestamine |
|
| Järgmise põlvkonna järjestamine (NGS) viitab kaasaegsetele suure jõudlusega sekveneerimisprotsessidele. Selles kirjeldatakse mitmeid erinevaid tänapäevaseid järjestustehnoloogiaid | Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri välja töötatud sekveneerimismeetod antud DNA fragmendi täpse nukleotiidijärjestuse määramiseks. |
| Kulutõhususe | |
| NGS on odavam protsess, kuna see vähendab aega, inimese võimsust ja kemikaale. | See on kulukas protsess, sest see võtab aega, inimese jõudu ja rohkem kemikaale. |
| Kiirus | |
| See on kiirem, kuna nii keemiline kui ka paljude ahelate signaali tuvastamine toimub paralleelselt. | See on aeganõudev, kuna keemiline tuvastamine ja signaali tuvastamine toimub kahe eraldi protsessina ja ainult ahelas saab lugeda korraga. |
| Usaldusväärsus | |
| NGS on usaldusväärne. | Sangeri järjestamine on vähem usaldusväärne |
| Näidissuurus | |
| NGS vajab vähem DNA kogust. | See meetod vajab suures koguses DNA matriitsi. |
| DNA alused järjestatud fragmendi kohta | |
| DNA aluste arv järjestatud fragmendi kohta on väiksem kui Sangeri meetodil | Genereerivad järjestused on pikemad kui NGS järjestused. |
Kokkuvõte - NGS vs Sangeri järjestamine
NGS ja Sangeri sekveneerimine on molekulaarbioloogias laialdaselt kasutatavad nukleotiidide järjestamise tehnikad. Sangeri sekveneerimine on varajane sekveneerimismeetod, mis asendati NGS-iga. Peamine erinevus NGS-i ja Sangeri järjestamise vahel on see, et NGS on kiire, täpsem ja kulutõhusam protsess kui Sangeri järjestamine. Mõlemad tehnikad tekitasid suuri geneetika ja biotehnoloogia puhanguid.
