Põhierinevus - Sangeri järjestamine vs pürosekveneerimine
DNA järjestamine on DNA analüüsi jaoks väga oluline, kuna teadmised konkreetse DNA piirkonna nukleotiidide õigest paigutusest näitavad selle kohta palju olulist teavet. DNA järjestamise meetodeid on erinevaid. Sangeri sekveneerimine ja pürosekveneerimine on kaks erinevat DNA järjestamise meetodit, mida molekulaarbioloogias laialt kasutatakse. Peamine erinevus Sangeri sekveneerimise ja pürosekveneerimise vahel on see, et Sangeri sekveneerimisel kasutatakse DNA sünteesi lõpetamiseks nukleotiidjärjestuse lugemiseks dideoksünukleotiide, samal ajal kui pürosekveneerimine tuvastab pürofosfaadi vabanemise, lisades nukleotiidid ja sünteesides komplementaarse järjestuse, et lugeda järjestuse täpset järjekorda.
SISU
1. Ülevaade ja põhierinevus
2. Mis on Sangeri järjestamine
3. Mis on pürosekveneerimine
4. Kõrvuti võrdlus - Sangeri järjestamine vs pürkjärjestus
5. Kokkuvõte
Mis on Sangeri järjestamine?
Sangeri sekveneerimine on esimese põlvkonna DNA sekveneerimismeetod, mille on välja töötanud Frederick Sanger ja tema kolledžid 1977. aastal. See on tuntud ka kui ahela lõpetamise ja dideoksü sekveneerimine, kuna see põhineb ahela katkestamisel dideoksünukleotiidide (ddNTP) poolt. Seda meetodit kasutati laialdaselt üle 30 aasta, kuni töötati välja uue põlvkonna järjestamine (NGS). Sangeri sekveneerimistehnika võimaldas avastada õige nukleotiidijärjestuse või kinnitada konkreetse DNA fragmendi. See põhineb ddNTP-de selektiivsel kaasamisel ja DNA sünteesi lõpetamisel in vitro DNA replikatsiooni ajal. 3'OH rühmade puudumine fosfodiestersideme moodustumise jätkamiseks külgnevate nukleotiidide vahel on ddNTP-de ainulaadne omadus. Seega, kui ddNTP on kinnitatud, lõpeb ahela pikenemine ja lõpeb sellest punktist. Sangeri järjestamisel kasutatakse nelja ddNTP-d - ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP. Need nukleotiidid peatavad DNA replikatsiooniprotsessi, kui need on integreeritud kasvavasse DNA ahelasse ja mille tulemuseks on erineva pikkusega lühike DNA. Kapillaargeeli elektroforeesi kasutatakse nende lühikeste DNA-ahelate korrastamiseks nende suuruse järgi geelil, nagu on näidatud joonisel 01.
Joonis 1: sünteesitud lühikese DNA kapillaargeeli elektroforees
DNA in vitro replikatsiooniks tuleks esitada vähe nõudeid. Need on DNA polümeraasi ensüüm, matriits-DNA, oligonukleotiidi praimerid ja deoksünukleotiidid (dNTP). Sangeri sekveneerimisel viiakse DNA replikatsioon läbi nelja eraldi katseklaasis koos nelja tüüpi ddNTP-ga eraldi. Deoksünukleotiidid ei ole täielikult asendatud vastavate ddNTP-dega. Torusse lisatakse konkreetse dNTP segu (näiteks; dATP + ddATP) ja see korratakse. Neli eraldi katseklaasi juhitakse geelil neljas eraldi süvendis. Seejärel saab geeli lugedes konstrueerida järjestuse, nagu on näidatud joonisel 02.
Joonis 02: Sangeri järjestamine
Sangeri sekveneerimine on oluline tehnika, mis aitab paljudes molekulaarbioloogia valdkondades. Inimese genoomi projekt viidi edukalt lõpule Sangeri sekveneerimispõhiste meetodite abil. Sangeri sekveneerimine on kasulik ka DNA sihtmärkide järjestamisel, vähi ja geneetiliste haiguste uurimisel, geeniekspressiooni analüüsimisel, inimese tuvastamisel, patogeeni tuvastamisel, mikroobide järjestamisel jne.
Sangeri järjestamisel on mitu puudust:
- Sekveneeritava DNA pikkus ei tohi olla pikem kui 1000 aluspaari
- Korraga saab järjestada ainult ühe ahela.
- Protsess on aeganõudev ja kulukas.
Seetõttu töötati nende probleemide ületamiseks aja jooksul välja uued täiustatud järjestamismeetodid. Kuid Sangeri järjestamine on endiselt kasutusel tänu oma väga täpsetele tulemustele kuni umbes 850 aluspaari pikkuse fragmendini.
Mis on pürose järjestus?
Pürosekveneerimine on uudne DNA sekveneerimistehnika, mis põhineb "sünteesimisel sekveneerimisel". See meetod põhineb pürofosfaadi vabanemise tuvastamisel nukleotiidi liitumisel. Protsessi kasutavad neli erinevat ensüümi: DNA polümeer, ATP sulfurülaas, lutsiferaas ja apüraas ning kaks substraati adenosiin-5 'fosfosulfaat (APS) ja lutsiferiin.
Protsess algab praimeri seondumisega üheahelalise DNA matriitsiga ja DNA polümeraas alustab sellega komplementaarsete nukleotiidide liitmist. Kui nukleotiidid ühinevad (nukleiinhapete polümerisatsioon), vabastab see pürofosfaadi (kaks omavahel seotud fosfaatrühma) rühmad ja energia. Iga nukleotiidi liitmine vabastab ekvimolaarse koguse pürofosfaati. Pürofosfaat muundub substraadi APS juuresolekul ATP-ks ATP-sulfurülaasi abil. Loodud ATP juhib lutsiferaasi vahendatud lutsiferiini muundumist oksülutsiferiiniks, tekitades nähtavat valgust kogustes, mis on proportsionaalsed ATP kogustega. Valgus tuvastatakse footonituvastusseadme või fotokordisti abil ja see loob pürogrammi. Apüraas lagundab reaktsioonisegus ATP-d ja inkorporeerimata dNTP-sid. dNTP lisamine toimub üks kord korraga. Kuna nukleotiidi lisamine on teada vastavalt valguse liitumisele ja tuvastamisele, saab määrata matriitsi järjestuse. Pürogrammi kasutatakse proovi DNA nukleotiidjärjestuse genereerimiseks, nagu on näidatud joonisel 03.
Pürosekveneerimine on ühe nukleotiidi polümorfismi analüüsimisel ja lühikeste DNA osade järjestamisel väga oluline. Suur täpsus, paindlikkus, automatiseerimise lihtsus ja paralleelne töötlemine on püroseeriatsiooni eelised võrreldes Sangeri sekveneerimistehnikaga.
Joonis 03: pürose järjestus
Mis vahe on Sangeri jadade järjestamisel?
Erinev artikkel keskel enne tabelit
Sangeri järjestamine vs pürose järjestus |
|
| Sangeri sekveneerimine on DNA sekveneerimismeetod, mis põhineb ddNTP-de selektiivsel liitmisel DNA polümeraasi ja ahela lõpetamise teel. | Pürosekveneerimine on DNA sekveneerimismeetod, mis põhineb pürofosfaadi vabanemise tuvastamisel nukleotiidi lisamisel. |
| DdNTP kasutamine | |
| ddNTP-sid kasutatakse DNA replikatsiooni lõpetamiseks | ddNTP-sid ei kasutata. |
| Kaasatud ensüümid | |
| Kasutatakse DNA polümeraasi. | Kasutatakse nelja ensüümi: DNA polümeraas, ATP sulfurülaas, lutsiferaas ja apüraas. |
| Kasutatud aluspinnad | |
| APS-i ja lutsiferiini ei kasutata. | Kasutatakse adenosiini 5'-fosfosulfaati (APS) ja lutsiferiini. |
| Maksimaalne temperatuur | |
| See on aeglane protsess. | See on kiire protsess. |
Kokkuvõte - Sangeri järjestamine vs pürose järjestus
Sangeri sekveneerimine ja pürosekveneerimine on kaks molekulaarbioloogias kasutatavat DNA järjestamise meetodit. Sangeri sekveneerimine konstrueerib järjestuses nukleotiidide järjestuse, lõpetades ahela pikenemise, samal ajal kui pürose järjestamine konstrueerib nukleotiidide täpse järjestuse järjestuses, lisades nukleotiidid ja tuvastades pürofosfaatide vabanemise. Seetõttu on peamine erinevus Sangeri ja pürosekveneerimise vahel selles, et Sangeri sekveneerimine toimib järjestuse järjestamisel ahela lõpetamise teel, samal ajal kui pürose järjestamine töötab järjestusega sünteesi teel.
