Peamine erinevus - Microarray vs RNA järjestus
Transkriptoom esindab kogu RNA sisaldust rakus, sealhulgas mRNA, rRNA, tRNA, lagundatud RNA ja lagundamata RNA. Transkriptoomi profileerimine on oluline protsess raku ülevaate mõistmiseks. Transkriptsiooni profileerimiseks on mitu täiustatud meetodit. Mikrokiibi ja RNA järjestamine on transkriptoomide analüüsimiseks välja töötatud kahte tüüpi tehnoloogia. Peamine erinevus mikrokiibi ja RNA järjestuse vahel seisneb selles, et mikrokiib põhineb eelnevalt kavandatud märgistatud sondide hübridiseerumispotentsiaalil siht-cDNA järjestustega, samas kui RNA järjestamine põhineb cDNA ahelate otsesel järjestamisel arenenud sekveneerimistehnikate, näiteks NGS abil. Microarray viiakse läbi eelnevate teadmistega järjestuste kohta ja RNA järjestamine viiakse läbi ilma eelnevate teadmisteta järjestuste kohta.
SISU
1. Ülevaade ja
põhierinevus 2. Mis on mikrorakeering
3. Mis on RNA järjestamine
4. Kõrvuti võrdlus - mikroraie vs RNA järjestus
5. Kokkuvõte
Mis on Microarray?
Microarray on kindel, usaldusväärne ja suure jõudlusega meetod, mida teadlased kasutavad transkriptsioonide profileerimiseks. See on ärakirjade analüüsi jaoks kõige populaarsem lähenemisviis. See on odav meetod, mis sõltub hübridisatsiooni sondidest.
Tehnika algab proovist mRNA ekstraheerimisega ja kogu RNA-st cDNA raamatukogu ehitamisega. Seejärel segatakse see tahkel pinnal (täppmaatriks) fluorestseeruvalt märgistatud etteantud sondidega. Täiendavad järjestused hübridiseeruvad mikrorajoonis olevate märgistatud sondidega. Seejärel pestakse ja sõelutakse mikrokihte ning kvantifitseeritakse pilt. Suhteliste väljendusprofiilide saamiseks tuleks kogutud andmeid analüüsida.
Eeldatakse, et mikrokiibi sondide intensiivsus on proportsionaalne proovis olevate transkriptide kogusega. Kuid tehnika täpsus sõltub kavandatud sondidest, eelteadmistest sondide järjestusest ja afiinsusest hübridiseerimiseks. Seega on mikrokihtimistehnoloogial piirangud. Microarray tehnikat ei saa teostada vähese arvukuse ärakirjadega. See ei suuda isovorme eristada ja geneetilisi variante tuvastada. Kuna see meetod sõltub sondide hübridisatsioonist, ilmnevad mikrokihtimistehnikas mõned hübridiseerimisega seotud probleemid, nagu risthübridisatsioon, mittespetsiifiline hübridisatsioon jne.
Joonis 01: mikrokiib
Mis on RNA järjestamine?
RNA jahipüssi sekveneerimine (RNA seq) on hiljuti välja töötatud kogu transkriptoomi sekveneerimise tehnika. See on kiire ja suure jõudlusega stenogrammide profileerimine. See kvantifitseerib otseselt geenide ekspressiooni ja selle tulemuseks on transkriptoomi sügav uurimine. RNA järjestus ei sõltu etteantud sondidest ega järjestuste eelnevatest teadmistest. Seetõttu on RNA seq meetodil kõrge tundlikkus ja võime tuvastada uusi geene ja geneetilisi variante.
RNA sekveneerimismeetod viiakse läbi mitmel etapil. Raku kogu RNA tuleb eraldada ja fragmenteerida. Seejärel tuleb pöördtranskriptaasi kasutades valmistada cDNA teek. Iga cDNA ahel tuleb ligeerida adapteritega. Seejärel tuleb ligeeritud fragmendid amplifitseerida ja puhastada. Lõpuks tuleb NGS-meetodi abil läbi viia cDNA järjestamine.
Joonis 02: RNA järjestamine
Mis vahe on Microarray ja RNA sekveneerimisel?
Erinev artikkel keskel enne tabelit
Microarray vs RNA järjestamine |
|
| Microarray on vastupidav, usaldusväärne ja suure jõudlusega meetod. | RNA järjestamine on täpne ja suure läbilaskevõimega meetod. |
| Maksumus | |
| See on odav meetod. | See on kallis meetod. |
| Suure hulga proovide analüüs | |
| See hõlbustab suure hulga proovide samaaegset analüüsimist. | See hõlbustab suure hulga proovide analüüsimist. |
| Andmete analüüs | |
| Andmete analüüs on keeruline. | Selle meetodi abil genereeritakse rohkem andmeid; seega on protsess keerukam. |
| Eelteadmised järjestustest | |
| See meetod põhineb hübridisatsiooni sondidel, seega on vajalik eelnev teadmine järjestuste kohta. | See meetod ei sõltu eelnevatest järjestusteadmistest. |
| Struktuurilised variatsioonid ja uudsed geenid | |
| See meetod ei suuda tuvastada struktuurilisi variatsioone ja uudseid geene. | See meetod võimaldab tuvastada selliseid struktuurilisi variatsioone nagu geenide liitmine, alternatiivne splaissimine ja uudsed geenid. |
| Tundlikkus | |
| See ei suuda tuvastada erinevusi isovormide ekspressioonis, seega on selle tundlikkus piiratud. | Sellel on kõrge tundlikkus. |
| Tulemus | |
| Selle tulemuseks võib olla ainult suhteline ekspressioonitase. See ei anna geeniekspressiooni absoluutset kvantifitseerimist. | See annab absoluutse ja suhtelise väljendustaseme. |
| Andmete uuesti analüüsimine | |
| Uuesti analüüsimiseks tuleb see uuesti läbi viia. | Järjestuse andmeid saab uuesti analüüsida. |
| Vajadus konkreetse personali ja infrastruktuuri järele | |
| Spetsiaalset infrastruktuuri ja personali pole mikrorajoonide jaoks vaja. | RNA sekveneerimiseks vajalik spetsiifiline infrastruktuur ja personal. |
| Tehnilised probleemid | |
| Microarray tehnikal on selliseid tehnilisi probleeme nagu risthübridisatsioon, mittespetsiifiline hübridisatsioon, üksikute sondide piiratud avastamismäär jne. | RNA seq tehnika abil välditakse selliseid tehnilisi probleeme nagu risthübridisatsioon, mittespetsiifiline hübridisatsioon, üksikute sondide piiratud avastamismäär jne. |
| Eelarvamused | |
| See on kallutatud meetod, kuna see sõltub hübridisatsioonist. | Eelsoodumus on mikrorajooniga võrreldes väike. |
Kokkuvõte - Microarray vs RNA järjestamine
Microarray ja RNA sekveneerimismeetodid on transkriptoomide profileerimiseks välja töötatud suure jõudlusega platvormid. Mõlemad meetodid annavad tulemusi, mis on väga korrelatsioonis geeniekspressiooni profiilidega. RNA sekveneerimisel on geeniekspressiooni analüüsimisel siiski eeliseid mikrorajooniga. RNA sekveneerimine on tundlikum meetod väikese arvukuse transkriptide tuvastamiseks kui mikrorajoon. RNA järjestamine võimaldab ka isovormide eristamist ja geenivariantide tuvastamist. Kuid enamiku teadlaste ühine valik on mikrokiht, kuna RNA järjestamine on uus ja kallis tehnika, mis sisaldab andmete salvestamise väljakutseid ja keerukat andmete analüüsi.
