Peamine erinevus - PCR praimerid vs järjestuse praimerid
Hiljutiste arengutega molekulaarbioloogia valdkonnas töötati välja erinevad geenitehnikad, mis muutsid uuritava eri suundade uurimisprotsessid lihtsaks ja täpseks. PCR ja muud sekveneerimisprotseduurid on kaks olulist sellist tehnikat. Nad kasutavad erinevaid alamkomponente. Praimereid peetakse peamiseks alamkomponendiks, mis on ühine nii PCR kui ka sekveneerimistehnikate puhul. PCR praimereid kasutatakse konkreetse DNA järjestuse amplifitseerimiseks, samas kui järjestuse praimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline järjestus nukleotiidjärjestuses. See on peamine erinevus PCR-praimerite ja sekveneerivate praimerite vahel.
SISU
1. Ülevaade ja peamine erinevus
2. Mis on PCR-praimerid
3. Mis on sekveneerivad praimerid
4. Sarnasused PCR-praimerite ja sekveneerivate praimeritega
5. Kõrvuti võrdlus - PCR-praimerid vs järjestus-praimerid tabelina
6. Kokkuvõte
Mis on PCR-praimerid?
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on geneetiline meetod, mida kasutatakse molekulaarbioloogia valdkonnas selleks, et võimendada ühe või mõne konkreetse DNA segmendi koopiat ja saada palju miljoneid ühesuguseid koopiaid. PCR-reaktsioonis kasutatakse erinevaid komponente, sealhulgas praimereid. Praimerid on lühikesed DNA-ahelad, mille nukleotiidipikkus on 18-25, muutes need ühilduvaks amplifitseeritavate DNA-fragmentide algus- ja lõpupiirkonnaga. Praimerid võivad olla ettepoole ja vastupidiseks praimeriks. Need praimerid seonduvad DNA fragmendiga spetsiifilistes kohtades, kus see paneb DNA polümeraasi seonduma spetsiifilise praimeriga asukohas ja algatama uue DNA ahela sünteesi.
Praimerite valik on PCR-protsessi oluline aspekt. Krundi pikkuse valik on oluline. Ideaalne pikkus oleks 18-25 nukleotiidi. Kui pikkus on liiga lühike või liiga pikk, ei seondu praimerid täpselt amplifitseeritava DNA järjestusega. Liiga lühikese pikkusega praimerid viivad mittespetsiifilise praimeri anniilimiseni DNA järjestuse erinevates kohtades.
Joonis 01: PCR-praimerid
Guaniini ja tsütosiini (GC) sisaldus heas praimeris peaks jääma vahemikku 40–60. Praimeri lõõmutamistemperatuur ja sulamistemperatuur on PCR-i ajal olulised tegurid. Sulamistemperatuur tuleks arvutada täpselt ja praimeri lõõmutamistemperatuur peaks olema sulamistemperatuurist 5 0 C madalam. Sulamistemperatuur peaks olema 60 ° C ja 75 ° C. Liiga kõrge või liiga madal temperatuur põhjustab vähem aktiivset DNA polümeraasi aktiivsust.
Mis on järjestuse alused?
Järjestuse praimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. Heade sekveneerimistulemuste saamiseks on olulised kvaliteetsed praimerid ja mallid. Seega, kui praimerid on valitud, peaksid need olema unikaalsed teatud piirkonnas, kus me soovime järjestust teha. Samuti peaks see olema õige orientatsiooniga, kus järjestused genereeritakse tavaliselt kruntide 3 'kuni 5' otsadest. Järjestusel peaks puuduma soovimatu enesehübridisatsioon, näiteks juuksenõela silmuste moodustumine. See ei tohiks sisaldada järjestikust guaniinaluste moodustumist.
Praimeri sulamistemperatuur (Tm) peab olema sekveneerimistingimuste jaoks sobiv. Seetõttu peaks see olema vahemikus 52 oC kuni 74 o C. Praimerina kasutatavate oligonukleotiidide ettevalmistamine tuleks puhastada, et saada järjestuse soovitud pikkus. Kui oligonukleotiidid sisaldavad lisandeid, asetatakse praimeri järjestuse signaalimine erinevatest praimimiskohtadest ja see vähendab ka alusrakkude arvu.
Joonis 02: Kruntide järjestamine
Oligonukleotiidi praimeri sulamistemperatuur (Tm) määrab, kui tugevad komplementaarsed DNA-ahelad omavahel hübridiseeruvad. Tm-d võib pidada termodünaamiliseks arvutuseks, kus see sõltub nii DNA järjestustest kui ka mitmest tingimusest, näiteks soola kontsentratsioonist. Tm on oluline PCR-i ajal, kus dideoksünukleotiidiga lõppenud fragmentide rühma tootmiseks kasutatakse varianti, mida nimetatakse tsüklijärjestuseks. Siin sekveneeritakse praimer algselt alternatiivselt, seejärel pikendatakse ja viimaks denatureeritakse amplifitseerimiseks. Seetõttu peaks Tm väärtus jääma vahemikku 52 o C kuni 74 oC. Sünteesitud oligonukleotiide saab vastavalt valikule saada DNA / RNA sünteesilaboritest. DNA sekveneerimiseks kasutatav väike sünteesimaht on tavaliselt 50 nmol. Samuti on kõige olulisem, et sekveneerimiseks kasutatavad praimerid tuleks puhastada nii, et selles ei oleks lisandeid, mis takistaksid kvaliteedi langust.
Millised on PCR-praimerite ja sekveneerivate praimerite sarnasused?
- Nii PCR-praimerid kui ka sekveneerivad praimerid on praimerid, mida kasutatakse suunatud DNA järjestuse amplifikatsiooniprotsessis.
- Nii PCR-praimerid kui ka sekveneerivad praimerid koosnevad nukleotiididest.
- Nii PCR-praimerid kui ka sekveneerivad praimerid on lühikesed oligomeerid.
Mis vahe on PCR-praimerite ja sekveneerivate praimerite vahel?
Erinev artikkel keskel enne tabelit
PCR praimerid vs järjestuse alused |
|
| PCR-praimerid on lühikesed DNA-ahelad, mille nukleotiidjärjestuse pikkus on 18-25, muutes need sobivaks amplifitseeritavate DNA-fragmentide algus- ja lõpupiirkonnaga. | Sekveneerivad praimerid on lühikesed oligomeerid, mida kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. |
| Funktsioon | |
| PCR praimereid kasutatakse konkreetse DNA järjestuse amplifitseerimiseks. | Järjestuse praimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. |
| Vajalike praimerite arv | |
| Kaks praimerit; ühte PCR-praimeritena kasutatakse ühte edasi-praimerit ja ühte pöörd-praimerit. | Vajab järjestamise praimerina ainult ühte praimerit. |
Kokkuvõte - PCR praimerid vs järjestuse alused
Järjestuse praimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. Protsessi käivitamiseks piisab ühest järjestuse praimerist. Heade sekveneerimistulemuste saamiseks on olulised kvaliteetsed praimerid ja mallid. Seega, kui praimerid on valitud, peaksid need olema unikaalsed teatud piirkonnas, kus me soovime järjestust teha. PCR-praimerid on lühikesed DNA-ahelad, mille nukleotiidide pikkus on 18-25, mis sobib amplifitseeritavate DNA-fragmentide algus- ja lõpupiirkonnaga. PCR praimerid võivad olla edasi-tagasi pöörd- ja pöörd-praimerid. Guaniini ja tsütosiini (GC) sisaldus heas praimeris peaks jääma vahemikku 40–60. Praimeri lõõmutamistemperatuur ja sulamistemperatuur on PCR-i ajal olulised aspektid. See on erinevus PCR-praimerite ja sekveneerivate praimerite vahel.
