PCR vs reaalajas PCR
PCR ehk polümeraasi ahelreaktsioon on kaasaegses molekulaarbioloogias murranguline avastus, mille arendas esmakordselt välja keemik Kary Mullis 1983. aastal. See võimaldab analüüsimiseks võimendada kompleksses DNA-s ühte järjestust. PCR-i põhiidee on see, et kaks praimerit, mis on komplementaarsed DNA järjestuse vastupidiste ahelatega, on üksteise suhtes orienteeritud; praimerid toodavad komplementaarseid ahelaid, millest kumbki sisaldab teist praimerit. Seega on tulemuseks suur hulk järjestust, mis vastab DNA-le, mis asub kahe praimeri vahel. Praimerite pikendamiseks PCR-s kasutatakse DNA polümeraasi ensüümi. DNA polümeraas on termostabiilne ensüüm ja sellel on võime püsida kõrgel temperatuuril (94 kuni 95 ° C), mida kasutatakse matriits-DNA denatureerimiseks.
PCR hõlmab kolme etappi, nimelt korduvaid denatureerimisvoorusid, praimerite lõõmutamist ja DNA sünteesi. Selle reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse termotsüklermasinat, et oleks võimalik programmeerida temperatuure kiiresti ja täpselt muutma. PCR-i rakendused on kriminaaluurimine, DNA sõrmejälg, patogeenide tuvastamine ja varajaste inimliikide DNA analüüs.
Mis on tavaline PCR?
Tavalisel PCR-il on kolm peamist etappi: DNA amplifikatsioonietapp, PCR eraldamine ja saaduste tuvastamine. DNA segmentide eraldamine toimub tavaliselt agaroosgeeli elektroforeesiga. Seejärel värvitakse saadused etheidimiimbromiidiga. Lõpuks saavutatakse detekteerimine ribade visualiseerimisega geelidele UV-valguses. Seetõttu ei väljendata tavapärase PCR lõplikke tulemusi numbritena. Tavaliselt suudab tavapärane PCR tuvastada ainult ühe parameetri.
Mis on reaalajas PCR?
Reaalajas PCR võimaldab tuvastada toodete amplifikatsiooni, kuna tooted on sünteesitud. Tehnoloogia arenguga on PCR muutunud väga populaarseks tehnikaks, eriti toiduainetes bakterite tuvastamiseks ja tuvastamiseks. Reaalajas PCR kasutab fluorestsentsvärvisüsteemi ja fluorotsentsi tuvastamise võimalusega termotsüklerit.
Mis vahe on tavalisel PCR-il ja reaalajas PCR-l?
• Tavapärane PCR on aeganõudvam, kuna amplifitseeritud PCR-toodete analüüsimiseks kasutatakse geelelektroforeesi. Seevastu reaalajas toimuv PCR on vähem aeganõudev, kuna see suudab amplifikatsiooni tuvastada reaktsiooni varases faasis.
• Reaalajas PCR kogub andmeid PCR-i eksponentsiaalse kasvufaasis, traditsiooniline PCR aga reaktsiooni lõpp-punktis.
• Tavapärase PCR-i lõpptulemused ei pruugi olla väga täpsed, kuid reaalajas toimuva PCR-i tulemused on väga täpsed.
• Reaalajas toimuv PCR on tundlikum kui tavaline PCR.
• Tavapärase PCR-i lahutusvõime on väga halb, samas kui reaalajas toimuva PCR-iga saab kõrge eraldusvõime tõttu tuvastada väga vähe muutusi.
• Tavapärase PCR-i tuvastamisel on lühike dünaamiline ulatus, reaalajas on aga lai dünaamiline ulatus.
• Erinevalt tavapärasest PCR-ist leidub automatiseeritud tuvastamise tehnikaid reaalajas PCR-is.
• Tavapärane PCR on väga keerukas ja töömahukas kui reaalajas PCR.
• Erinevalt reaalajas toimuvast PCR-ist ei saa tavapärane PCR eristada surnud ja elusaid baktereid.
• Reaalajas PCR kasutab toodete tuvastamiseks fluorestsentsvärvisüsteemi, tavapärases PCR-s aga agariosgeelisöötmes olevate ribade visualiseerimiseks etiidiumbromiidi ja UV-valgust.
