Peamine erinevus - PCR vs DNA järjestamine
PCR ja DNA järjestamine on molekulaarbioloogias kaks olulist tehnikat. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on protsess, mis loob suure hulga DNA fragmendi koopiaid. DNA sekveneerimine on meetod, mille tulemuseks on antud DNA fragmendi nukleotiidide täpne järjestus. See on peamine erinevus PCR ja DNA järjestuste vahel. PCR on üks peamisi etappe, mis on seotud DNA sekveneerimisega.
SISU
1. Ülevaade ja peamine erinevus
2. Mis on PCR
3. Mis on DNA järjestamine
4. Kõrvuti võrdlus - PCR vs DNA järjestamine
5. Kokkuvõte
Mis on PCR?
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on DNA amplifikatsiooni tehnika, mida kasutatakse molekulaarbioloogias. See toodab konkreetse DNA fragmendi tuhandeid kuni miljoneid koopiaid. Selle meetodi töötas välja Kary Mullis 1983. Selles meetodis toimib amplifitseeritava DNA fragment matriitsina ja DNA polümeraasi ensüüm lisab PCR segus saadaolevale praimerile komplementaarsed nukleotiidid. PCR-reaktsiooni lõpus sünteesitakse palju proovi DNA koopiaid.
PCR-segul on erinevad komponendid, sealhulgas DNA, DNA polümeraas (Taq polümeraas), praimerid (edasi- ja pöördpraimerid), nukleotiidid (DNA ehituskivid) ja puhver. PCR toimub PCR-masina sees ja masinasse tuleks laadida õige PCR-segu ning juhtida õiget programmi. See tehnika võimaldab toota tuhandeid kuni miljoneid konkreetse DNA osa koopiaid väga väikesest DNA kogusest.
PCR-reaktsioonid toimuvad tsükliliselt, et tekitada geelil nähtav kogus PCR-tooteid. PCR-reaktsioonil on kolm peamist etappi, nimelt denatureerimine, praimeri lõõmutamine ja ahela pikendamine, nagu on näidatud joonisel 01. Need kolm etappi toimuvad kolmel erineval temperatuuril. DNA eksisteerib kaheahelalises vormis vesiniksidemete abil komplementaarsete aluste vahel. Enne implitseerimist tuleb kaheahelaline DNA üksteisest eraldada. Seda tehakse kõrge temperatuuri andmisega. Kõrgel temperatuuril denatureerub kaheahelaline DNA üksikuteks ahelateks. Seejärel peaksid praimerid jõudma lähemale konkreetse fragmendi või DNA geeni külgnevatele otstele. Primer on lühike üheahelaline DNA, mis on märklaudjärjestusega komplementaarne. Edasised ja tagurpidi praimerid lõõmutavad komplementaarsete alustega denatureeritud proovi DNA külgnevates otstes lõõmutamistemperatuuril. Krundid peaksid olema kuumuskindlad. Kui praimerid anniilivad proovi DNA-ga, alustab taq polümeraasi ensüüm uute ahelate sünteesi, lisades nukleotiide, mis on komplementaarsed siht-DNA-ga. Taq-polümeraas on termostabiilsest ensüümist, mis on eraldatud termofiilsest bakterist nimega Thermus aquaticus. PCR-puhver säilitab optimaalsed tingimused taq-polümeraasi toimeks. Neid kolme PCR-reaktsiooni etappi korratakse, et saada vajalik kogus PCR-produkti. Pärast iga PCR-reaktsiooni kahekordistatakse DNA koopia. Seega saab PCR-is täheldada eksponentsiaalset amplifikatsiooni. PCR-saadusi saab jälgida geelelektroforeesi abil ja neid saab edasiste uuringute jaoks puhastada.
Joonis 01: PCR-reaktsiooni peamised etapid
PCR on meditsiiniliste ja bioloogiliste uuringute jaoks väärtuslik vahend. PCR-il on kohtuekspertiisi eriline väärtus, kuna see võib kurjategijate väikestest proovidest uuringute jaoks DNA-d võimendada ja teha kohtuekspertiisi DNA-profiile. PCR-i kasutatakse laialdaselt paljudes molekulaarbioloogia valdkondades, sealhulgas genotüpiseerimine, geenide kloonimine, mutatsioonide tuvastamine, DNA järjestamine, DNA mikrokiibid ja isaduse testimine jne.
Joonis 02: polümeraasi ahelreaktsioon
Mis on DNA järjestamine?
DNA järjestamine on antud DNA fragmendis nukleotiidide - adeniini, guaniini, tsütosiini ja tümiini - täpse järjekorra määramine. Geneetiline teave salvestatakse DNA järjestustesse, kasutades nukleotiidide õiget järjekorda. Seega on geenide struktuuri ja funktsiooni tundmiseks DNA-fragmendis nukleotiidide täpse järjekorra leidmine väga oluline.
DNA järjestamise protokoll hõlmab erinevaid protsesse. Esimene samm on huvitatud DNA või organismi genoomse DNA eraldamine. Kasutades PCR-i (nagu eespool kirjeldatud), tuleks DNA soovitud piirkond amplifitseerida. Võimendatud PCR-produkt tuleks geelelektroforeesiga eraldada ja puhastada. Amplifitseeritud fragmente serveeritakse mallidena sekveneerimisel. Järjestust saab teha kas järgides Sangeri järjestust või suure läbilaskevõimega sekveneerimismeetodit. Sangeri sekveneerimine nõuab saadud DNA fragmentide kapillaarelektroforeesi. Õige nukleotiidide järjekorra saab määrata autoradiograafide käsitsi lugemise või automatiseeritud DNA sekvenaatorite abil.
Geenide järjestamine aitas kaasa inimese genoomiprojektile ja hõlbustas 2003. aastal inimese genoomi kaardistamist. Kohtuekspertiisis võimaldas DNA järjestamine identifitseerida isendeid, kellel on ainulaadsed DNA järjestused ja kurjategijad. Meditsiinis saab DNA järjestamist kasutada geneetiliste ja muude haiguste eest vastutavate geenide avastamiseks, defektgeenide leidmiseks ja nende asendamiseks õigete geenidega. Põllumajanduses kasutatakse majanduslikult soovitud omadustega transgeensete põllukultuuride saamiseks mõnede mikroorganismide DNA sekveneerimise teavet.
Joonis 03: DNA järjestamine
Mis vahe on PCR-il ja DNA järjestamisel?
Erinev artikkel keskel enne tabelit
PCR vs DNA järjestamine |
|
| PCR-protsess loob huvitatud DNA fragmendist tuhandeid kuni miljoneid koopiaid. | DNA järjestamine on protsess, mille käigus määratakse antud DNA fragmendis olev nukleotiidide täpne järjestus. |
| Tulemus | |
| PCR loob tuhandeid kuni miljoneid konkreetse DNA fragmendi koopiaid | Selle tulemuseks on aluste õige järjekord konkreetses DNA fragmendis. |
| DdNTP-de kaasamine | |
| PCR ei vaja ddNTP-sid. See kasutab dNTP-sid. | DNA järjestamine nõuab ddNTP-sid ahela moodustumise lõpetamiseks. |
Kokkuvõte - PCR vs DNA järjestamine
PCR ja DNA järjestamine on väga olulised vahendid paljudes molekulaarbioloogia valdkondades. DNA fragmentide amplifitseerimine viiakse läbi PCR-meetodil, samas kui DNA-fragmentide nukleotiidide õige järjestus määratakse DNA järjestuse abil. See on erinevus PCR ja DNA järjestuse vahel.
