Põhja-Lõuna- Ja Lääne-Blotingu Erinevus

2024 Autor: Mildred Bawerman | [email protected]. Viimati modifitseeritud: 2023-12-16 08:38

Põhierinevus - Põhja vs Lõuna vs Lääne Blotting

DNA, RNA ja valkude spetsiifiliste järjestuste tuvastamine on molekulaarbioloogia erinevat tüüpi uuringute jaoks hädavajalik. Geelelektroforees on tehnika, mis eraldab DNA, RNA ja valgud nende suuruse järgi. Geelprofiilide põhjal tuvastatakse konkreetne DNA järjestus, RNA järjestus või valk spetsiaalsete tehnikatega, mida nimetatakse blottimiseks ja hübridisatsiooniks märgistatud sondidega. Blotimismeetodeid on kolme tüüpi, nimelt lõuna-, põhja- ja läänemeetodid. Põhiline lõuna- ja läänepoolse määrimise erinevus seisneb proovis tuvastatava molekuli tüübis. Southern blot on meetod, mis tuvastab DNA proovist konkreetse DNA järjestuse. Northern blotting on meetod, mis tuvastab RNA proovist spetsiifilise RNA järjestuse. Western blotting on meetod, mis tuvastab valguproovist spetsiifilise valgu.

SISU

1. Ülevaade ja põhierinevus

2. Mis on Southern Blotting

3. Mis on Northern Blotting

4. Mis on Western Blotting

5. Kõrvuti võrdlus - Northern vs Southern vs Western Blotting

6. Kokkuvõte

Mis on Southern Blotting?

Southern blot tehnika töötati välja EM Southern poolt 1975. aastal spetsiifilise DNA järjestuse tuvastamiseks DNA proovist. See on esimene molekulaarbioloogias kasutusele võetud blotimistehnika. See võimaldas tuvastada spetsiifilisi geene DNA-st, spetsiifilisi fragmente DNA-st jne. Lõuna-blot tehnikas on mitu etappi. Need on järgmised.

1. Proovist eraldatakse DNA ja digereeritakse restriktsiooni endonukleaasidega.
2. Seeditud proov eraldatakse agaroosgeeli elektroforeesiga.
3. Geelis olevad DNA fragmendid denatureeritakse leeliselise lahuse abil üksikuteks ahelateks.
4. Üheahelaline DNA kantakse kapillaaride ülekandega nitrotselluloosi filtrimembraanile.
5. Ülekantud DNA kinnitatakse membraanile püsivalt.
6. Fikseeritud DNA membraanil hübridiseeritakse märgistatud proovidega.
7. Seondumata DNA pestakse membraanilt pesemisega.
8. Röntgenfilmi eksponeeritakse membraanile ja valmistatakse ette autoradiograaf.

Southern blot-d kasutatakse molekulaarbioloogia erinevate aspektide jaoks. See on kasulik RFLP kaardistamisel, kohtuekspertiisi uuringutes, DNA metüleerimisel geeniekspressioonis, muteerunud geenide tuvastamisel geneetiliste häirete korral, DNA sõrmejälgede võtmisel jne.

Joonis 01: Lõuna-blottimistehnika

Mis on Northern Blotting?

Northern blotting on meetod, mis on loodud konkreetse RNA järjestuse või mRNA järjestuse tuvastamiseks proovist geeniekspressiooni uurimiseks. Selle tehnika töötasid välja Alwine, Kemp ja Stark 1979. aastal. See erineb lähi- ja lääneosa blottimistehnikast mitme etapi tõttu. Kuid see meetod viiakse läbi ka geelelektroforeesi, blotimise ja hübridiseerimise teel spetsiifiliste märgistatud sondidega ja tuvastamise teel. Northern blotting tehnika viiakse läbi järgmiselt.

1. RNA ekstraheeritakse proovist ja eraldatakse geelelektroforeesiga.
2. RNA kantakse geelilt määrimismembraanile ja fikseeritakse.
3. Membraani töödeldakse märgistatud sondiga, mis on valmistatud cDNA-st või RNA-st (sond on komplementaarne proovis sisalduva kindla järjestusega).
4. Sondi inkubeeritakse membraaniga kindla järjestusega seondumiseks.
5. Seondumata sondid pestakse.
6. Hübridiseeritud fragmendid tuvastatakse autoradiograafiga.

Northern blotting on oluline vahend hübridiseeritud mRNA tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks, uurides RNA lagunemist, RNA poolväärtusaja hindamist, RNA splaissingu tuvastamist, geeniekspressiooni uurimist jne.

Joonis 02: Northern Blotting

Mis on Western Blotting?

Western blot on meetod spetsiifilise valgu tuvastamiseks valgusegust märgistatud antikeha abil. Seetõttu on Western blot tuntud ka kui immunoblot. Selle tehnika võtsid kasutusele Towbin jt 1979. aastal ja seda viiakse nüüd laboratoorselt läbi valgu analüüsimiseks. Sammud on järgmised.

1. Proovist ekstraheeritakse valgud
2. Valgud eraldatakse nende suuruse järgi, kasutades polüakrüülamiidgeeli elektroforeesi
3. Eraldatud molekulid kantakse elektroporatsiooni teel PVDF-i või nitrotselluloosmembraanile
4. Membraan blokeeritakse mittespetsiifilise seondumise eest antikehadega
5. Ülekantud valgud seotakse primaarse antikehaga (ensüümiga märgistatud antikehad).
6. Membraan pestakse mittespetsiifiliselt seotud primaarsete antikehade eemaldamiseks
7. Seondunud antikehad tuvastatakse substraadi lisamise ja moodustunud värvilise sademe tuvastamise teel

Western blot on kasulik HIV-vastaste antikehade tuvastamiseks inimese seerumiproovis. Western blotti võib kasutada ka B-hepatiidi nakkuse kinnitava testina ja hullu lehma haiguse lõpliku testina.

Joonis 03: Western blotting

Mis vahe on Põhja-Lõuna ja Lääne-Blottingu vahel?

Erinev artikkel keskel enne tabelit

Põhja vs Lõuna vs Lääne blotting
Tuvastatud molekuli tüüp
Põhja-Blotting	Northern blotting tuvastab RNA proovist spetsiifilise RNA järjestuse.
Southern Blotting	Southern blotting tuvastab DNA proovist spetsiifilise DNA järjestuse.
Western Blotting	Western blot tuvastab valguproovist spetsiifilise valgu.
Geeli tüüp
Põhja-Blotting	Selleks kasutatakse agaroosi / formaldehüüdgeeli.
Southern Blotting	Selleks kasutatakse Agarose geeli.
Western Blotting	Selleks kasutatakse polüakrüülamiidgeeli.
Blotimismeetod
Põhja-Blotting	See on kapillaaride ülekanne.
Southern Blotting	See on kapillaaride ülekanne.
Western Blotting	See on elektriline ülekanne.
Kasutatud sondid
Põhja-Blotting	cDNA või RNA sondid, mis on märgistatud radioaktiivselt või mittradioaktiivselt.
Southern Blotting	DNA sondid on märgistatud radioaktiivselt või mitte-radioaktiivselt.
Western Blotting	Sondidena kasutatakse primaarseid antikehi.
Tuvastussüsteem
Põhja-Blotting	Selleks kasutatakse autoradiograafi või valguse või värvi muutuse tuvastamist.
Southern Blotting	Selleks kasutatakse autoradiograafi, valguse või värvimuutuse tuvastamist.
Western Blotting	Selleks kasutatakse valguse või värvimuutuse tuvastamist.

Kokkuvõte - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotimine on spetsiaalne tehnika, mis on välja töötatud proovide spetsiifilise DNA, RNA või valgu tuvastamiseks. Spetsiifilise molekuli tuvastamiseks on kolm eraldi blottimisprotseduuri, nimelt põhja-, lõuna- ja läänepoolne osa. Northern blot meetod on loodud konkreetse RNA järjestuse tuvastamiseks RNA segust. Southern-blot-tehnika võimaldab tuvastada spetsiifilist DNA järjestust DNA-proovist ja välja töötatakse Western-blot-tehnika spetsiifilise valgu identifitseerimiseks valgusegust.